2006 年底，美國(guó)霍華德‐休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇實(shí)驗(yàn)組開發(fā)出來一種類似于 PALM 的方法，可以用來研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨率定位。他們發(fā)現(xiàn)，不同的波長(zhǎng)可以控制化學(xué)熒光分子 Cy5 在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色 561nm 的激光可以激活 Cy5 發(fā)射熒光，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間照射可以將 Cy5 分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光。之后，用綠色的 488nm 激光照射 Cy5 分子時(shí)，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)，而此過程的長(zhǎng)短依賴于D二個(gè)熒光分子 Cy3 與 Cy5 之間的距離。因此，當(dāng) Cy3 和 Cy5 交聯(lián)成分子對(duì)時(shí)，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長(zhǎng)的特性。將 Cy3 和 Cy5 分子對(duì)膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白。應(yīng)用特定波長(zhǎng)的激光來激活探針，然后應(yīng)用另一個(gè)波長(zhǎng)激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環(huán)上百次后就可以得到*后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù) (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。2007 年，他們進(jìn)一步改進(jìn) STORM 技術(shù)，發(fā)展了不同顏色的變色熒光分子對(duì)，可以同時(shí)記錄兩種甚至多種蛋白質(zhì)的空間相對(duì)定位，從而闡明籠形蛋白 clathrin 形成的內(nèi)吞小泡與細(xì)胞骨架蛋白之間的精確空間位置關(guān)系，兩種顏色的分辨率都可以達(dá)到 20～30nm。原理如下圖：

STORM 通過一對(duì)染料對(duì)通過隨機(jī)發(fā)光空間定位，實(shí)現(xiàn)了 XY 20 nm 分 辨率。

SIM
改變光學(xué)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來突破光學(xué)J限的另一個(gè)方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。早在 1963 年，Lukosz 和 Marchand 就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以用來增強(qiáng)顯微鏡分辨率的理論。2005 年，加州大學(xué)舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微鏡上，得到了分辨率達(dá)到 50nm 的圖像。SSIM 技術(shù)的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分辨率的信息。如圖所示：

SIM 通過結(jié)構(gòu)照明莫爾紋原理實(shí)現(xiàn)了任何熒光染料都可以達(dá)到 XY 100nm。

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