對于傳統(tǒng)的光學顯微鏡，光的衍射讓成像分辨率限制在大約250 nm。如今，超分辨率技術(shù)可以將此提高10倍以上。這種技術(shù)主要通過三種方法實現(xiàn)：單分子定位顯微鏡，包括光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）；結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）；以及受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）。

如何選擇超分辨率技術(shù)，這是大家都關(guān)心的。“不幸的是，并沒有簡單的原則來決定使用哪種方法，”英國牛津大學的博士后研究員Mathew Stracy說。“每一種都有其自身的優(yōu)點和缺點。”

科學家當然也在想辦法，為特定的項目選擇合適的方法。以色列理工學院的助理教授Yoav Shechtman表示：“在生物成像的背景下，要考慮的關(guān)鍵因素包括：空間和時間分辨率、對光損傷的敏感性、標記能力、樣本厚度，以及背景熒光或細胞自體熒光。”

工作原理

各種超分辨顯微鏡是以不同的方式工作的。以PALM和STORM為例，在特定時刻，只有一小部分熒光標記激發(fā)或光活化，使得它們能夠高精度地獨立定位。讓所有熒光標記都經(jīng)歷這個過程，這也就帶來了一幅完整的超分辨率圖像。2014年諾貝爾化學獎的獲得者之一、馬普生物物理化學研究所主任Stefan Hell表示：“PALM/STORM系統(tǒng)相對容易搭建，但比較難以應用，因為熒光基團必須具有光活化能力。局限之處在于它們需要檢測細胞背景下的單個熒光分子，在可靠性上不及STED?！?/span>

STED使用激光脈沖來激發(fā)熒光基團，并使用環(huán)形的激光來淬滅熒光基團，只留下中間納米大小的熒光而得到超高分辨率。掃描整個樣本，可生成一幅圖像?！癝TED的優(yōu)勢在于它是一種按鈕技術(shù)，”Hell解釋說?！八闷饋砭拖駱藴实墓簿劢?a href="http://ycfc114.com/cp/yingguangxianweijingxilie/">熒光顯微鏡?！彼€可以利用一些熒光基團對活細胞進行成像，比如綠色或黃色的熒光蛋白和羅丹明衍生染料。

參數(shù)對比

盡管所有超分辨率技術(shù)在分辨率上都超越了傳統(tǒng)的光學顯微鏡，但彼此也各不相同。SIM大約將分辨率提高一倍，達到100 nm左右。PALM和STORM則可以分辨15 nm的目標。據(jù)Hell介紹，STED在活細胞中可提供30 nm的空間分辨率，在固定細胞中可達15 nm。

在涉及到特定應用時，我們還必須考慮信噪比。在有些情況下，分辨率較低但信噪比較高可能會比相反情況（分辨率較高但信噪比較低）帶來更好的圖像。

圖像獲取的速度也相當重要，特別是對于活細胞?！八械某直媛始夹g(shù)都比常規(guī)的熒光成像技術(shù)要慢，”Stracy說?！癙ALM/STORM是*慢的，需要成千上萬幀來獲得單幅圖像，SIM需要幾十幀，而STED是一種掃描技術(shù)，所以采集速度取決于視野的大小。”

除了活細胞或固定細胞成像，一些科學家也想了解對象如何移動。Stracy就很有興趣了解活細胞中生物系統(tǒng)的動力學，而不僅僅是靜態(tài)圖像。他將PALM與單顆粒追蹤相結(jié)合，來分析活細胞中的動力學。通過這種方式，他可以在標記分子行使功能時直接追蹤它們。不過，他認為SIM并不適合研究這些分子水平的動態(tài)過程，但是由于獲取速度快，它特別適合觀察較大結(jié)構(gòu)的動力學，如整條染色體。

聊聊標記

在許多超分辨率應用中，標記真的很重要。目前也有一些公司提供相關(guān)產(chǎn)品。例如，德國美天旎和Stefan Hell創(chuàng)辦的公司Abberior合作，為超分辨顯微鏡染料提供定制抗體結(jié)合服務。

其他的一些公司也提供與之相匹配的標記。ChromoTek的營銷人員Christoph Eckert表示：“我們的Nano-Booster非常小，只有1.5 kDa，而且高度特異?！边@些蛋白質(zhì)可與綠色和紅色熒光蛋白（GFP和RFP）相結(jié)合。它們來源于羊駝抗體片段，被稱為VHH或納米抗體，具有出色的結(jié)合性能，并且質(zhì)量穩(wěn)定，沒有批間差。這些標記適合各種超分辨率技術(shù)，包括SIM、PALM、STORM和STED。

馬里蘭大學醫(yī)學院的助理教授Ai-Hui Tang及其同事利用ChromoTek的GFP-Booster以及STORM，來探索神經(jīng)系統(tǒng)中的信息傳播。他們在突觸前和突觸后神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了分子納米簇，將其稱之為納米柱（nanocolumn）?？茖W家認為，這種結(jié)構(gòu)表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)采用簡單的原理來維持和調(diào)節(jié)突觸效率。

各種版本的超分辨率成像以及越來越多的方法正帶領(lǐng)科學家更深入地領(lǐng)略生物學奧秘。在打破了可見光的衍射極限后，生物學家甚至可以“嚴密監(jiān)視”細胞的行動。