激光共聚焦顯微鏡是一種先進的細胞生物醫(yī)學分析儀器,它在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置,并使用計算機進行圖像處理。以下是激光共聚焦顯微鏡的觀察方式介紹:
一、基本原理
激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,采用激光束作為光源,激光束經照明針孔,經由分光鏡反射至物鏡,并聚焦于樣品上。組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質,受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡,通過探測針孔時先聚焦,聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測收集,并將信號輸送到計算機,處理后在計算機顯示器上顯示圖像。
二、觀察方式
點照明與點探測
激光光源通過照明針孔發(fā)射出的光,聚焦在樣品焦平面的某個點上。
該點所發(fā)射的熒光在探測針孔上成像,該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。
照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的,因此被探測點即共焦點,被探測點所在的平面即共焦平面。
掃描成像
計算機以“像點”的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上。
為了產生一幅完整的圖像,由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上進行逐點、逐行、逐面的快速掃描。
通過控制調焦深度,可以獲得樣品不同深度層次的圖像,這些圖像信息都儲于計算機內,通過計算機分析和模擬,就能顯示所觀察表面的立體結構。
三維圖像重建
激光掃描共聚焦顯微鏡具有細胞“CT”功能,可以在不損傷細胞的情況下,獲得一系列光學切片圖像。
通過“Z-Stack”模式,可以確定光學切片的位置及層數,并啟動掃描,*終獲得三維圖像。
時間序列圖像獲取
“Time-Series”功能可以自動在實驗者規(guī)定的時間內按照設定的時間間隔獲取圖像。
只需設定所需的時間間隔以及所需圖像數量,即可進行實驗,這對于熒光漂白恢復和鈣離子成像等實驗非常實用。
三、應用優(yōu)勢
高分辨率與高對比度
激光共聚焦顯微鏡比普通熒光顯微鏡獲得更高對比度、高分辨率圖像。
能夠對細胞或組織內部微細結構進行清晰成像。
多重熒光觀察
可以實現(xiàn)多重熒光的同時觀察,并可形成清晰的三維圖像。
實時動態(tài)檢測
可進行活體細胞或組織功能的實時動態(tài)檢測,如測定細胞內鈣變化、pH變化、膜電位變化等。
無損傷檢測
對檢測樣品無損傷,具有良好的可靠性和重復性。
四、應用領域
激光共聚焦顯微鏡在生命科學、醫(yī)學研究中應用廣泛,包括但不限于:
細胞或亞細胞形態(tài)結構的研究
檢測蛋白質、抗體及其他大分子
檢測細胞凋亡
細胞器的觀察和測定(線粒體、溶酶體、內質網和高爾基體)
檢測細胞融合
觀測細胞骨架
檢測細胞間隙連接通訊
檢測細胞或組織內脂肪
細胞或組織結構的三維重構
綜上所述,激光共聚焦顯微鏡以其獨特的觀察方式和廣泛的應用優(yōu)勢,在生物醫(yī)學研究中發(fā)揮著重要作用。