制作激光共聚焦顯微鏡的樣品是一個涉及多個步驟的過程,以下是一個清晰的制作流程,結(jié)合了參考文章中的相關(guān)信息:
1. 組織采集與固定
采集:根據(jù)實驗條件和目的采集不同來源的組織。
固定:
液氮冷凍法:新鮮組織采集后,直接放入液氮中保存。
多聚甲醛(PFA)固定法:適用于小鼠、大鼠等實驗動物的組織。將組織塊置于4% PFA中進(jìn)行后固定,固定的時間可根據(jù)組織塊的大小和致密程度調(diào)整,如4℃固定過夜或室溫1~4 h。
2. 組織保存與預(yù)處理
洗滌:用0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次,每次10~30 min。
脫水:在20%蔗糖中4℃浸泡1 h以上,待組織塊下沉后,即可進(jìn)行后續(xù)步驟。
保存:組織塊可置于4℃冰箱保存于20%蔗糖(含0.05% NaN?)中,一個月內(nèi)完成切片。
3. 冷凍包埋與切片
冷凍:
氣體CO?冷凍包埋法:將組織塊放在濾紙上吸取表面液體,放入樣品臺的冷凍包埋劑(OCT)中,用CO?氣體迅速冷凍組織樣品。
液氮冷凍法:將組織塊置于樣品臺的OCT中,先在液氮中迅速浸提幾次,直至樣品溫度與液氮溫度平衡,之后移至冷凍切片機(jī)中。
切片:使用冷凍切片機(jī),將組織切成5~15 μm的切片,粘貼于處理過的載玻片上。
4. 免疫熒光抗體標(biāo)記
切片處理:將冷凍組織切片從-80℃冰箱中取出,室溫放置10min,待切片回溫并干燥,浸于PBS中10min洗去OCT。
標(biāo)記:無需Triton處理,即可進(jìn)行免疫熒光抗體標(biāo)記,操作步驟與培養(yǎng)細(xì)胞反應(yīng)方法相同。
5. 封片與保存
封片:使用抗熒光淬滅的封片劑封片,以減少熒光信號丟失。
保存:4℃保存,等待觀察。
注意事項
樣品承載物:如觀察貼壁細(xì)胞或組織切片,可用普通載玻片和蓋玻片;如觀察懸浮細(xì)胞或懸浮粒子,可用共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿。
染料選擇:根據(jù)共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇熒光染料,避免不同熒光染料的發(fā)射波長重疊。
通過遵循以上步驟和注意事項,可以制作出適用于激光共聚焦顯微鏡的高質(zhì)量樣品。